Mechanisms of Apoptosis in Cancer: Regulatory Role of Caspases vorgelegt von Diplom-Chemiker

Die vorliegende Arbeit gewährt Einblick in biochemische Signalwege, die in verschiedenen Zellsystemen zu apoptotischem Zelltod nach Behandlung mit Zytostatika führen. Die Arbeit überspannt zwei Bereiche: die Identifizierung des initiierenden Signalweges bei Zytostatika-induzierter Apoptose in der humanen B-Zell Lymphom Zellinie BJAB und Einblick in Apoptose-bezogene Ereignisse, die durch Zytostatikabehandlung induziert werden. Die Verifizierung, daß Zytostatikabehandlung nicht nur das Zellwachstum hemmt sondern auch Apoptose induziert, ist der erste Schritt. Der erste Bereich behandelt spezifische Ereignisse/Proteine die mit der Apoptose assoziiert sind: Um den initiierenden Signalweg bei Zytostatika-induzierter Apoptose zu bestimmen, wird die Kaskade der apoptotischen Ereignisse am Endpunkt der Apoptose beginnend aufgedeckt: Zytostatika-induzierter Zelltod wurde mittels Trypan-Blau Färbung untersucht und die Quantifizierung ergab, daß etwa 60% der behandelten BJAB-Zellen nach 72 Std. sterben. Weitere Charakteristika der Apoptose wurden, dem Signalweg aufwärts folgend, mittels immunchemischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden untersucht. Die Fragmentierung der DNA wurde durch durchflußzytometrische Analyse bestimmt; Aktivierung der Caspasen wurde sowohl durch WesternBlot Analyse als auch in Caspase-spezifischen Aktivitäts-Assays detektiert. Hierdurch wird gezeigt, daß während der Apoptose die DNA degradiert wird, was in einer gesteigerten Zahl hypodiploider Zellen resultiert, die bis zu 60% nach 72 Std. erreichen. Eines der Caspase-Substrate, Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), wird spezifisch während der Zytostatika-induzierten Apoptose in BJAB-Zellen gespalten, was durch Western-Blot Analyse gezeigt wird. Desweiteren werden Caspase-3-, Caspase-9und Caspase-8-Aktivierung mittels Western-Blot Analyse detektiert. Die Prozessierung der Caspase-8 warf die Frage auf, welches der Startpunkt der Caspase-Kaskade bei Zytostatika-induzierter Apoptose ist, da Caspase-8 im allgemeinen als die am Anfang der Protease-Kaskade stehende Initiator-Caspase bei der CD95/Fas induzierten Apoptose betrachtet wird. Der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials, ein Ereignis, das oberhalb der Aktivierung von Caspase-9 gelegen ist, wurde mittels durchflußzytometrischer Analyse untersucht unter Gebrauch des Farbstoffes JC-1 (5,5 ́,6,6 ́-tetrachloro-1,1 ́,3,3 ́-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanin iodide), der sensitiv auf Veränderungen im mitochondrialen Membranpotential reagiert. Für BJAB-Zellen konnte ein signifikanter Verlust des mitochondrialen Membranpotentials gezeigt werden, der in 80% der mit Taxol-behandelten und 60% der Epirubizin-behandelten Zellen nach 72 Std. nachgewiesen wurde. Um im weiteren die Rolle der Caspase-8 Prozessierung zu untersuchen, wurden stabil transfizierte Zellen, die eine dominantnegative Mutante des Adaptermoleküls FADD (Fas assoziiertes Protein mit Todesdomäne) exprimieren, eingesetzt. FADD ist notwendig zur Formierung des Todes-indu-